一、塗片、幹燥、固定、初染(媒染)、脫色、複染  
(1) 塗片:臨床標本或液體培養物可直接塗抹於潔淨的載玻片上,固體培養的細菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水,然後取菌少許在鹽水中磨勻,呈輕度混濁。塗好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。 
(2)幹燥  塗片最好在室溫下自然幹燥,或將標本麵向上,置於酒精燈火焰高處慢慢烘幹,切不可在火焰上燒幹。 
(3)固定  細菌的固定常用火焰加熱法,即將上述已幹的塗片在火焰中迅速通過3~5次,溫度以手能摸時熱而不燙為度。目的在於殺死細菌,凝固細胞質,改變細菌對染料的通透性。 
(4) 初染:不同的染色方法,所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。 
(5) 媒染:通過媒染可增加染料和被染物質的親和力。媒染劑還可用於固定之後,亦可含在固定液或染液中。 
(6) 脫色:此步驟主要目的是觀察細菌與染料間結合的穩定程度,作為鑒別染色之用。 
(7) 複染:細菌初染色被脫色後常以複染液複染,便於觀察。複染液的顏色與初染液有明顯不同。  

二、常用染料原液配製 
 一般製備100ml純酒精飽和溶液所需染料量:美蘭2g~5g;結晶紫7g~14g;堿性複紅3g~7g。  

三、常用的染色方法 
1、單染色法  即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸複紅染液。 
染液 :①呂氏美蘭液,美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成;②稀釋石炭酸複紅液  堿性複紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml,然後用蒸餾水作10倍稀釋即成。 
2、菌種:大腸埃希菌普通斜麵培養物。 
3、染色方法:於已做好的塗片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸複紅染液,染色1min,以水衝洗至無顏色流下為止,自然幹燥或以遠火烘幹後鏡檢。     
4、結果:以美蘭染色者菌體呈現蘭色;以稀釋石炭酸複紅染色的菌體呈現紅色。